豬偽狂犬病的實驗室診斷方法

供稿:豬豬俠

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    偽狂犬病(PseudorabiesPR)最早報道于20世紀初,曾席卷整個歐洲地區,造成了巨大經濟損失。1947年,我國豬偽狂犬病的實驗室診斷方法首次在貓身上分離到了偽狂犬病毒,并開始快速傳播,2011年,我國出現了變異毒株,對我國的畜牧業,尤其是養豬業造成巨大威脅。目前,大部分歐洲發達國家已經根除傳統的PR,但在我國仍頻繁發生,并混雜變異毒株的感染,根除難度大,如何研制出更加高效的基因疫苗、阻止病毒的肆意傳播尤為重要。

     

    通過臨床表現只能做出初步診斷,確診還需進行實驗室檢查。現將常用的實驗室診斷法介紹如下。

     

    病原的分離鑒定:采集新鮮的病料。可取病豬的各個臟器組織碎塊作為病料,用經滅菌后的PBS進行勻漿處理,添加雙抗置于4℃過夜,離心后取上清接種于易感單程細胞(如VeroPK-15HelaBHK-1)上,等待觀察病變,如未出現病變,可盲傳一代再觀察。此方法可確診偽狂犬病毒,但靈敏性較低。

     

    ELISA法:利用抗原-抗體特異性結合的原理進行抗原的檢測,可用于大量樣品的檢測。此方法的類型很多,包括普通的ELISA法、雙抗加心、斑點ELISA、競爭ELISA、鑒別診斷ELISA等,各種方法細節略有不同,但都操作簡單,易于推廣。經大量實驗數據表明,病豬的腦組織、肺臟和扁桃體取樣所檢出偽狂犬病毒的檢出率較高,且結果準確。

     

    PCR技術:此方法快速、高效、特異性強,需要一定的實驗技術水平。目前,DNA提取試劑盒已經普遍,可以方便、快速地從病料組織中提取目的DNA,設計偽狂犬病毒的特異性保守序列引物,進行PCR擴增,用瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定。

     

    DNA探針技術:以PCR技術作為基礎,將偽狂犬病毒的一段保守片段進行克隆作為探針材料,進行目的基因的擴增。結果準確、靈敏度高,但此方法操作復雜,成本較高。

     

    中和實驗:將病毒接種于單層細胞進行傳代培養,用特性的抗體進行微量血清中和實驗,易于判斷結果,可用于大量樣品的檢測,但整體效果低于ELISA檢測法。

     

    免疫熒光技術:此方法是利用熒光色素對待檢抗原或抗體先進行免疫熒光標記,再進行抗原-抗體結合實驗,進行熒光標記的示蹤。目前,此方法被證實可直接用于檢測病豬的臟器組織,其中,淋巴結和扁桃體的檢出率最高。

     

    免疫接種試驗:可將分離好的病毒接種于陰性實驗兔的腿部肌肉或腹腔皮下,注射2d后在注射部位可看到自咬癥狀,最終死亡,可確診為PR。但此方法靈敏性不高,不易于大量樣品確診。

     

    免疫程序及影響因素:我國豬場一般在新生仔豬出生13日齡內通過鼻內接種相關疫苗,70d后進行肌肉接種。對母豬和后備豬進行季度性接種,每年免疫34次。PR的疫苗種類有很多,包括弱毒苗、滅活苗、基因工程疫苗、缺失苗、亞單位苗、多價苗等,不同苗的免疫效果存在顯著區別。滅活苗安全性明顯好于弱毒苗,不會引起機體排毒,使用安全,但其保護效力低于弱毒苗。影響疫苗效果的因素有很多,包括添加的佐劑、免疫途徑、宿主自身的免疫功能強弱等。添加佐劑的目的為了提高抗體水平,增強免疫效果,佐劑作用的高低與佐劑的種類有關。

     

    目前,很多歐洲發達國家已經根除豬偽狂犬病,想要根除該病,基因缺失苗的構建和與之相對應缺失蛋白的鑒別診斷至關重要。美國于20世紀末啟動PR根除計劃,在本世紀初宣布徹底消除,其所用的就是基因缺失苗。英國花費了約2.6億英鎊徹底消除了PR。德國只使用gE缺失苗進行免疫,于2000年徹底凈化該病。我國的流行情況較為復雜,雖然PR只存在一個血清型,但存在變異毒株,毒力存在差異,當豬感染偽狂犬病毒后,還會繼發感染其他疾病,如豬瘟、藍耳病等,加大了治療和防控難度,在我國想徹底凈化該病需所有科研人員、獸醫工作者共同努力。


    (審核編輯: 豬豬俠)

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